1、在实验过程中要防止 RNA 的降解,保持 RNA 的完整性。在总 RNA 的提取过程中,注意避免 mRNA 断裂。
2、为了防止非特异性扩增,必须设阴性对照。
3、内参的设定
主要为了用于靶 RNA 的定量。常用的内参有 G3PD(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、β-Actin(β-肌动蛋白)等。其目的在于避免 RNA 定量误差、加样误差以及各 PCR 反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。
4、PCR 不能进入平台期,出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标 DNA 起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数,均应通过单独实验来确定。
5、防止 DNA 的污染
采用 DNA 酶处理 RNA 样品,在可能的情况下,将 PCR 引物置于基因的不同外显子,以消除基因和mRNA 的共线性。
6、所有的玻璃器皿均应在使用前于 180℃的高温下干烤6小时或更长时间。
7、塑料器皿可用 0.1% DEPC(diethyl pyrocarbonate,焦碳酸二乙酯)去离子水浸泡或用氯仿冲洗(注意:氯仿会腐蚀有机玻璃器具)。
8、有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在 3% H2O2 室温 10分钟,然后用 0.1% DEPC去离子水冲洗,晾干。
9、配制的溶液应尽可能的用 0.1% DEPC,在 37℃处理 12小时以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂,应当用DEPC 处理过的无菌双蒸水配制,然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
10、操作人员戴一次性口罩、帽子、手套,实验过程中手套要勤换,尽量避免其他人员干扰。
11、设置 RNA 操作专用实验室,所有器械等应为专用。
12、DEPC 是蛋白质强变性剂,它和 RNA 酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。具强挥发性,致癌物,因而使用时应在通风橱操作,需戴一次性手套,一次性口罩,小心操作。
13、RT试剂盒从冰箱拿出,应该充分解冻,瞬离后,混匀,放于冰上,可在冰上加样。试剂可以用数字贴纸编号,避免漏加、错加试剂。
14、取用不同的试剂时,必须更换吸头,样本之间要避免交叉污染。
15、逆转录时,PCR仪可以先预热。
16、反应体系配好之后,应充分混匀,瞬离,并且弹去管内的气泡。
17、实验过程中应预防RNA酶污染,使用无酶吸头以及EP管,同时台面可以使用固相RNA酶去除剂清洁。
18、PCR时,管壁尽量避免写字。
19、管盖一定要盖严。
20、10μL 逆转录反应体系建议加入不超过500ng 的 RNA。
21、如果目的基因表达量非常低,最多加入1μg Total RNA,否则加入RNA量过高,可能会超出后续PCR的线性范围。
22、反应体积可根据需要等比例放大。
23、试剂尽量不要反复冻融。
24、每个样品至少3个平行孔,所有成分加完后,离心去除气泡。
25、可将所有共同物质加入同一管中,混匀后分散入其他管中。