由于操作简单、快速、精准等的优点，荧光PCR方法检测病原体已成为常规的检测技术之一，但对于刚开始学习，缺乏经验的我们，面对一堆名词，往往会一头雾水。比如荧光定量PCR技术是什么？扩增曲线、标准曲线、域值、CT值、熔解曲线、基线到底都代表什么意思？荧光定量PCR曲线的每个参数代表什么？我们又怎样去分析扩增结果？今天就带大家一起学习一下这些知识和概念。

PCR是Polymerase Chain Reaction(聚合酶链式反应)的首字母缩写，简单说来，PCR是由高温变性—低温退火—中温延伸三个基本反应步骤构成：

1、DNA的变性成为单链

模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链解离成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；

2、低温退火

模板DNA变性成单链后，将其温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

3、中温延伸

DNA模板——引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。

荧光PCR方法是指在PCR反应体系中加入荧光基团，随着PCR扩增的进行，反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加，最后通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图，对PCR进程进行实时检测。

扩增曲线

扩增曲线是指PCR过程中，以循环数为横坐标，以反应过程中实时荧光强度为纵坐标所做的曲线。

基线(Baseline)

基线是指在PCR扩增反应的最初的数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线的线。

荧光域值(threshold)

一般将反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，一般设置是3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光阈值设定在PCR扩增的指数期(默认阈值=基线(背景)信号标准差×10)。一般来说，每台仪器在使用前都已经设置好了荧光阈值。

CT值

CT值表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小，反之亦然。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标难曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数。纵坐标代表CT值。因此，只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

判断扩增曲线是否良好的指标主要有几个方面：

① 曲线拐点清楚，特别是低浓度样本指数期明显，扩增曲线整体平行性好，基线平而无上扬现象，低浓度样本扩增曲线指数期明显。

② 曲线指数期斜率与扩增效率成正比，斜率越大扩增效率越高。

③ 标准的基线平直或略微下降，无明显的上扬趋势。

④ 各管的扩增曲线平行性好，表明各反应管的扩增效率相近。

标准曲线

将标准品稀释至不同浓度，作为模板进行PCR反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的CT值作为纵坐标，绘制标准曲线。对未知样品进行定量时，根据未知样本的CT值，即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。标准曲线在绝对定量的时候非常重要。

斜率

从线性方程上看，计算公式为斜率=-1/lg(1+扩增效率)。如果从标准曲线上得到斜率( -3.3)，就可以算出扩增效率( 0.99)。一般来讲 PCR扩增效率在90%-110%都是可以用于数据分析的。效率低于 100%，是由于PCR反应中存在抑制因素；而高于 100%可能一些污染、非特异性扩增或者是引物二聚体造成。

相关系数R²

用以反映变量之间相关关系密切程度的统计指标。相关系数在0.99以上，得到的斜率才比较有意义。当然，样本量一定要足够，比如做标准曲线时，最少要有四个点以上，即四个不同的初始浓度，结果才可信。因此，我们只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线(标曲)上计算出该样品的起始拷贝数。

熔解曲线

对PCR产物加热，随着温度的升高，双链扩增产物逐渐解链，导致荧光强度下降，到达某一温度时(Tm)，会导致大量的产物解链，荧光急剧下降。利用该特点以及不同PCR产物其Tm值的不同，因此使其荧光信号发生迅速下降的温度也不同，可通过此对PCR的特异性进行鉴定。

熔解曲线(取对数曲线)

对熔解曲线取对数，形成峰图，更直观的显示产物片段的情况。由于熔解温度即是该DNA片段的Tm值，以此可以判断影响DNA片段Tm值的一些参数，比如片段大小、GC含量等等。一般来说，根据我们的引物设计原则，扩增产物长度在80-300bp范围，那么熔解温度应该是在80℃-90℃之间。

① 如果在80℃-90℃之间出现唯一主峰，说明荧光定量PCR完美；

② 如果在80℃-90℃之间出现主峰，80℃以下出现杂峰，基本考虑引物二聚体，可尝试提高退火温度解决；

③ 如果在80℃-90℃之间出现主峰，温度上升又出现杂峰，基本上考虑有DNA污染，需要在实验初始阶段去除DNA。