基本信息

产品描述

Necrostatin-1是一种特异性RIP1 (RIPK1)抑制剂，抑制TNF-α诱导的细胞坏死，在293T细胞中EC50为490 nM。

靶点（IC50 & Targe）

RIP1,490nM(EC50)

体外研究

Necrostatin-1 (1-100 μM) 抑制过表达和内源性的RIP1发生自磷酸化。RIP1是初级细胞靶点，负责Necrostatin-1的抗细胞坏死活性。[1] Necrostatin-1有效抑制多种类型细胞触发的坏死性细胞死亡。Necrostatin-1作为细胞坏死的小分子抑制剂, 作用于jurkat细胞，抑制RIP激酶的诱导细胞坏死，抑制TNF-α诱导的细胞坏死，EC50为490 nM。[2]

激酶实验

RIP1 激酶检测:

RIP1 的磷酸化需要其激酶活性。FLAG标记的野生型(WT)或RIP1(K45M) 突变体失活激酶的表达结构转染到293T细胞中，在有γ-32PATP存在时，RIP1激酶实验在30°C下进行30分钟。样品进行SDS-PAGE，通过放射自显影可观察到RIP1带。对放射性带的相对强度进行量化，并显示比率。在激酶反应的同时，珠样本使用anti-RIP1抗体进行Western Blot分析，确保与激酶反应中等量的蛋白。

细胞实验

Cell lines: Jurkat, BALB/c 3T3, SV40-转化的MEF, L929

Concentrations: 0.01-100 μM

Incubation Time: --

Method:细胞接种在96孔板中（白色板进行发光检测;黑色板进行荧光检测;空白板进行MTT实验）贴壁细胞按每孔5000-10000个细胞的密度接种，悬浮细胞按每孔20,000-50,000个细胞的密度接种，孔中含100 μl合适的无酚红培养基。温育后，使用如下方法之一测定细胞存活率。ATP 实验中，使用购买的发光试剂盒，并使用Wallac Victor II酶标仪分析发光值。Sytox实验中,细胞与 1 μM Sytox Green试剂在37°C下温育30分钟,然后进行荧光读数。随后，增加5 μl 20% Triton X-100溶液到每孔中，产生最大溶解，细胞37°C下温育1小时，然后进行二次读数。Triton处理前和后，计算值的比率。MTT实验，使用CellTiter 96 AQueous 非放射性细胞增殖检测试剂盒。PI排除实验中, 加入2 μg/ml PI 到培养基中，立即使用FACSCalibur分析样品。PI-膜联蛋白V 实验中，使用ApoAlert Annexin V-EGFP 凋亡试剂盒。进行DioC6染色, 细胞与40 nM DiOC6 在37°C下温育30分钟, 洗涤一次，使用FACSCalibur分析。ROS分析中, 细胞与5 μM Dihydroethidium在37°C下温育30分钟, 洗涤一次，使用FACSCalibur分析。

(Only for Reference)

参考文献

[1] Degterev A, et al. Nat Chem Biol, 2008, 4(5), 313-321.

[2] Degterev A, et al. Nat Chem Biol, 2005, 1(2), 112-119.

安全信息

图形或危害标志
提示语	Warning
危险说明	H315 H319 H335
防范说明	P261 P271 P280
WGK	3