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梯度洗脱常见问题与解决办法
2023.03.27   点击2461次

梯度洗脱中所出现的故障与等度洗脱非常类似,主要包括以下方面:第一是与仪器故障实验技术、色谱柱故障等有关;第二是由于试验条件不当设置导致分离方面问题(分离度差、宽峰等)。下表汇总了梯度洗脱常见故障及解决方法。

现象问题解决办法
色谱图前面的峰挤成一团,且分离度较差起始流动相太强在开始的梯度中减少溶剂B的比例(%)
色谱图中间峰分离度差条件欠佳增加k'、N和α,改变梯度时间、流速、柱长
色谱图前面的峰保留不重复柱平衡差(1)增加两次梯度之间的再生时间
(2)—定的间隔进样
基线漂移溶剂A和B有不同的紫外吸收值(1)加非保留的紫外吸收剂以抵消溶剂吸收的波动;
(2)用不同波长检测;
(3)用不同检测器
在空白的梯度中有伪峰试剂或流动相不纯(1)用HPLC级试剂
(2)纯化流动相的组分
部分色谱峰分离度突然变差溶剂分层用键合相柱代替多孔硅胶柱

(1)基线漂移

如果B溶剂(甲醇)比A溶剂(水)吸收大,梯度洗脱时基线上升,在低紫外波长检测更加厉害。一个解决的办法是加有紫外吸收的组分到A或B溶剂中,以均衡两种溶剂的吸收。加紫外吸收剂的一个要求是在梯度洗脱条件下无保留。也可加氧化亚氮在A(水)中。在185nm〜200nm处检测常加低浓度的硝酸盐;在高检测波长加周期表中高族的盐(如溴酸盐、高碘酸盐)。

(2)伪峰

在流动相中存在有紫外吸收的杂质,用梯度洗脱能分离出来,即不进相关的样品也照常出峰。如用普通的蒸馏水或含有杂质的溶剂就会不断出峰或基线漂移,建议用HPLC级的水和溶剂。

(3)溶剂分层

在梯度洗脱中用硅胶柱最易出现这种现象。若B溶剂活性很强(如丙醇),A溶剂极性很弱(如正己烷)。在梯度初始阶段B溶剂被柱所吸收,继续梯度B溶剂就打破平衡。可能在色谱图上某些点分离度明显降低,个别峰特别窄,而两侧峰又比较宽。在窄峰这一点上,正好B溶剂破坏了平衡,然后又分层。分析时要注意选用对B溶剂吸收低的柱,用键合相的柱很少发生这种现象。溶剂的互溶性,不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相,有些溶剂在一定比例内混溶,超出范围就不互溶,使用时更要引起注意。当有机溶剂和缓冲液混合时,还可能析出盐的晶体,尤其使用磷酸盐时需特别小心。

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