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间充质干细胞微载体/片状载体培养细胞计数解决方案
作者:艾贝泰   2024.10.10   点击18次
 间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSC)是一类多能干细胞,能够分化为多种细胞类型,有很强的自我更新能力,具有免疫调节功能,且能分泌多种生物活性因子促进组织修复和再生。因此,MSC在再生医学、组织工程、免疫调节、药物筛选等方面有着广泛的应用潜力。
 
  MSC属于贴壁依赖的细胞,通常需要附着在培养表面才能保持干性以及有效增殖和生长。为了进一步发挥MSC的功能,通常会利用微载体或者片状载体进行大规模培养。在MSC的微载体/片状载体培养过程中,常规使用的是胰酶消化后的细胞悬液进行细胞计数,观察MSC细胞浓度变化和活率变化,但也面临一些问题:
 
  胰酶消化微载体上的细胞,往往不能完全消化;
 
  胰酶过度消化也容易造成细胞损伤,活性下降。
 
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  艾贝泰Countleader®双荧光细胞计数仪,搭配艾贝泰自产细胞裂解液A+B,可很好的解决胰酶消化操作复杂、结果准确性低的问题。
 
  MSC微载体培养计数方法  
 
  首先将培养的MSC样本分为两份:
 
  一份样本中按等体积加入Reagent A100 裂解缓冲液处理微载体悬浮培养物,裂解缓冲液使细胞质膜通透并从微载体上释放细胞核。然后用等体积的Reagent B稳定细胞核,形成稳定的细胞核悬液(样品1),取样品1与AOPI染料1:1 混合,吸取15μL 染色后的细胞样品加入到FL8-slides耗材的待测通道中(通道1)。
 
  另外一份样本(样品2)同时与AOPI染料1:1 混合, 吸取15μL染色后的细胞样品加入到FL8-slides耗材的待测通道中(通道2)。
 
  Countleader® FL 1000细胞计数仪内置“Viability and Cell Count Assay A100 And B”分析方法。通道1获得总细胞浓度,通道2获得死细胞浓度。 
 

 
  PI能够与死细胞、细胞裂解后的细胞核染色,呈现红色荧光。无需手动计算,设备软件自行运算,直接快速、准确的获得微载体培养MSC的活细胞浓度以及活率。
 
 

通道1:总细胞核图像通道2:死细胞核图像

   MSC片状载体培养计数方法  
 
  收集2-3个片状载体至50 mL离心管中,加入适量体积(淹没整个片状载体为准)的Reagent A100 裂解缓冲液,裂解10 min(按照不同载体材质,裂解时间可分别设置5 min、10 min、15 min、20 min等,如果延长时间后,细胞数量没有显著增加,可以确定最佳孵育时间),加入等体积的Reagent B 稳定细胞核,混合均匀。
 
  取裂解完毕后的混合液与AOPI染料1:1 混合,吸取15μL 染色后的细胞样品加入到FL8-slides耗材的待测通道中。Countleader® FL 1000细胞计数仪内置“Viability and Cell Count Assay (AOPI)”分析方法,设置样本名称、视野面积以及稀释倍数。PI能够与细胞裂解后的细胞核染色,呈现红色荧光。
 
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·裂解后细胞核图片·
 
  细胞计数结果:片载体细胞浓度(cells/cm2=
 
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  注:艾贝泰提供的Reagent A100和Reagent B也可用于结团细胞的裂解计数,精确获得结团细胞的计数结果。
 
  Countleader® FL 1000细胞计数仪,具备台盼蓝、AOPI双荧光双分析模式,8通道耗材,操作简单,重复性好,符合FDA的21 CFR Part11的要求!
 
 


 
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