原核表达是指利用基因克隆技术，通过构建到表达载体将外源目的基因转化至宿主细胞中，使其在原核生物体内稳定表达，从而获得大量目的蛋白的方法。通过查阅相关文献资料，本文汇总了原核表达实验过程中常见的问题，分析了可能存在的原因以及解决办法。

问题一：出现短截蛋白/无蛋白表达。

答：1.蛋白被水解了；2.大肠杆菌的密码子偏爱性使得翻译起始位点出现了错误；3.基因本身存在着特殊结构。

可以通过：1.使用两端都带有融合标签的载体，这样可以在洗脱时将全长蛋白和截断蛋白区分开来；2.对密码子进行优化；3.使用稀有密码子的菌株Rosetta 2, Rosetta-gami 2, Rosetta-gami B, RosettaBlue。

问题二：出现包涵体。

答：二硫键形成困难/基因表达过快，表达量过高。

可以通过可以通过控制优化表达水平；降温；IPTG浓度优化等方法解决。

问题三：蛋白无活性。

答：可能原因为蛋白发生了错误折叠。

解决方法同问题二。

问题四：细胞死亡，生长极困难。

答：可能原因为目的蛋白为毒性蛋白，对宿主细胞产生了影响。

可以通过1.更为严格的本底表达控制；2.可以尝试使用PlysS菌株。

问题五：通过His标签纯化的蛋白杂带较多，该如何改进？

可以通过：1.如果纯化的是上清，可能是蛋白酶部分降解了目的蛋白，可通过加多种蛋白酶抑制剂改进。

2.可提高杂蛋白与镍柱结合起始咪唑浓度，以降低杂蛋白与镍柱的亲和力。

3.杂蛋白和目的蛋白结合，可通过超声前加入去垢剂的方式消除（1%-2%Tritonx-100）。

问题六：镍株使用过程中出现棕色怎么办？

答：出现这样的情况，主要是缓冲液中 DTT （二硫苏糖醇）的影响，DTT 会对镍柱的颜色和纯化效率有很大的影响，所以所有镍柱的生产商都强调要尽量避免 DTT 的参与（一般的镍柱耐受小于 5 mM DTT，推荐缓冲液中不要超 2 mM DTT）。

问题七：镍株堵住了怎么办？

答：1. 柱子发生堵塞，可能是样品中细胞碎片或其他杂颗粒所致，所以样品一定要高速离心。

2. 上清纯化时，蛋白发生变性，有絮状物产生，赶紧加入1-2 mM DTT （上清样品处理要在冰浴中进行），还不行加尿素变性，使其在变性环境下。

3. 样品处理时的料液比不要太小，否则黏度大，或者导致蛋白析出或变性，料液比要在 1/10-1/15 之间较适宜。

问题八：蛋白纯化过程中出现浑浊怎么办？

答：1. 出现浑浊，说明蛋白处在不稳定的环境中或者自身就不稳定，所以要检查缓冲体系是否正确，环境温度，或在缓冲液中加入还原剂 DTT。

2. 加入肌氨酸钠，迅速使蛋白变性，消除浑浊现象。

问题九：未能洗脱到带His标签的蛋白是什么原因？

答：1. 超声的功率不对（太大，蛋白炭化，太小，蛋白没有释放）；

2. 样品或者是结合缓冲液不正确；

3. 组氨酸的标签没有完全的暴露；

4. His 标签丢失。

可以通过：1. 改变超声功率，并在超声前加入溶菌酶；

2. 检测 pH 及样品和结合缓冲液的组成份（EDTA）；

3. 在变性条件下（用 8M 脲，6M 盐酸胍，1%SDS） 并加入 1-2mMDTT 进行纯化；

4. WB 或者 anti-his 的抗体检查 His 是否表达，上游构建，改变 his-tag 的位点，必要时增加 his 个数（常用 6-10 个）；

5. 孵育的时间不够，降低流速和增加孵育的时间；

6. 改变螯合的金属离子，寻找到最佳的结合金属离子。

问题十：蛋白在柱子上洗脱不下来怎么办？

答：（1）洗脱条件太温和。

策略：增加咪唑的梯度洗脱或降低pH。

（2）降低PH 的方法洗脱的，因为若PH 低于3.5，会导致镍离子脱落。

策略：改变洗脱办法，咪唑竞争性洗脱。

（3）蛋白已沉淀在柱上。

策略：减少上样量和孵育的时间，试用去污（1%-2% Tritonx-100）或改变NaCl 的浓度，或在变性条件下洗脱（用8M 脲，或6M 盐酸胍），最终也可在洗脱Buffer 中加入2mM DTT 或者0.5%肌氨酸钠进行洗脱。

（4）非特异性疏水或其他相互反应。

策略：加非离子去污剂到洗脱缓冲液（如，2%Triton X-100）或增加NaCl 的浓度。

问题十一：如何处理样品可使其初步提纯？

答：（1）上清样品处理，要加入去污剂，蛋白酶抑制剂，还原剂，还要注意温度及超声破碎的参数。

（2）去大肠杆菌自身带（两条30 Kd-40 Kd）可用非变性缓冲液超声悬浮（加入去垢剂），离心6000 r/min，30min，10℃。（若效果不够可继续上述步骤）。

（3）大肠杆菌包涵体的洗涤，可用包涵体洗液多洗几遍，也可用1M/2M/4M/8M 尿素逐步溶解，可选取其中纯度最佳的。

（4）可用硫酸铵沉淀法，初步提纯。