1.什么是CRISPR/Cas9敲除细胞系

CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是新出现的一种由sgRNA指导Cas核酸内切酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。CRISPR/Cas9系统广泛存在于原核生物基因中，是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的一种适应性免疫防御机制。

2.CRISPR/Cas9敲除细胞系的原理

CRISPR/Cas系统分为两大类，最典型和应用最广泛的 CRISPR 系统是 II 型 CRISPR/Cas9 系统。在II型CRISPR系统中，CRISPR RNA（crRNA）通过碱基配对与转录激活crRNA（Trans-activating crRNA，tracrRNA）退火形成能够特异识别基因组序列的复合体，然后通过PAM（5’-NGG-3’）序列结合并侵入DNA，引导Cas9核酸内切酶在目的片段切割使DNA双链断裂（double-strand breaks，DSBs）。 

3.CRISPR/Cas9敲除细胞系的服务优势

（1）具有编辑效率高、构建简单、操作方便等优点

（3）能够成本低廉地实现有效灵活的基因敲除

（4）具有广谱性，无基因、细胞及物种限制

（5）可实现多个靶位点同时进行基因打靶

（6）功能丰富，可实现敲除、插入、抑制、激活等多种目的基因

4.CRISPR/Cas9敲除细胞系主要应用方向

CRISPR/Cas9敲除细胞系广泛应用于许多领域，特别是在遗传疾病治疗、疾病相关基因的筛选和检测、肿瘤治疗、动植物转化以及病原微生物的预防等领域具有巨大的潜力，可以有效改善人类的生活质量。

5.CRISPR/Cas9敲除细胞系面对的挑战

尽管之前的解释表明 CRISPR/Cas9 是一种很有前途的方法，但这种编辑系统仍然存在许多局限性和风险，由于其最近在人类中的发现和使用，使其在临床试验中的使用具有挑战性。免疫原性、脱靶、多态性、递送技术和伦理问题是主要的限制和困难。

6.CRISPR/Cas9敲除细胞系的全流程介绍

CRISPR/Cas9敲除细胞系，主要流程如下：gRNA设计，细胞转染，单细胞克隆，单克隆筛选，单克隆测序分析，交付报告。 

6.1 gRNA设计

6.1.1用 BbsI 在 37℃条件下酶切载体质粒 pAC1371。

6.1.2参照DNA 片段回收试剂盒说明书回收目的载体。

6.1.3引物退火

使用以下参数在 PCR 环仪中进行退火:

37℃ 30 分钟，95℃ 5 分钟，然后以每分钟降低 5℃的速度将温度降到 25℃。

6.1.4连接酶连接。

6.1.5质粒转化（Transformation）

（1）取DH5a 感受态细胞放在冰上解冻，解冻后将5-10μL连接产物添加到感受状态细胞中，用枪头轻轻搅拌均匀(切勿剧烈震动)，在冰箱中静置孵化25-30分钟。

（2）将感受态细胞放入冰上孵化后，提前调节温度至42℃的水浴锅中，加热90秒。

（3）加入 500μL 提前预热至室温的液体培养基，置于 37℃摇床中复苏摇菌 1 小时。

（4）3000 转离心 3 分钟，弃掉部分上清液，用灭菌冷却至室温的玻璃棒涂板，置于 37℃培养箱中过夜生长。

（5）随机挑取独立生长的菌斑于液体培养基中培养 6-8 小时，进行菌落 PCR。

（6）将 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳。凝胶成像仪成像，选取阳性菌落送去测序公司进行测序鉴定。

（7）根据测序结果选取目的菌落扩大培养，提取质粒，备后续实验室用。

6.2细胞转染

6.2.1准备：细胞准备，将长势良好 HEK293T 细胞按一定数量传代。

6.2.2将长势良好，密度适当的 HEK293T 细胞更换一半新鲜培养基。

6.2.3 pMD2.G: 1μg+paspax2: 1μg +transgene: 2μg+optimem: 0.126mL 混匀，室温静置5 分钟， lipofectamine 2000：8μL+optimem: 0.125mL 混匀，室温静置 5 分钟。

6.2.4  5 分钟后将步骤 5.2 .3中的两种混合物轻柔的混合在一起，室温静置 15 分钟。

6.3单细胞克隆

100 个细胞铺在一个大盘或 96 孔板中。剩余的细胞冻存。当肉眼可见类似于菌落的细胞团时，将其从大盘或 96 孔板消化下来转移至 12 或 24 孔板中继续扩大培养。注意不要污染到其它细胞团，不要选取过密的细胞团。

6.4单克隆筛选

使用特定的筛选标记，如荧光蛋白或抗生素抗性基因，也可以帮助筛选成功敲除目标基因的克隆。

6.5单克隆测序分析

使用聚合酶链式反应（PCR）来扩增目标基因的DNA序列，并通过凝胶电泳或测序技术来检测是否存在突变或缺失。