琼脂糖凝胶电泳迁移速率的影响因素：

1、 DNA的分子大小及构型

不同构型DNA的移动速度次序为：共价闭环DNA(covalently closed circular，cccDNA)>直线DNA>开环的双链环状DNA。线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。当琼脂糖浓度太高时，环状DNA(一般为球形)不能进入胶中，相对迁移率为0(Rm=0)，而同等大小的直线双链DNA(刚性棒状)则可以长轴方向前进(Rm>0)，由此可见，这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度。

2、琼脂糖浓度

一个给定大小的线状DNA分子，其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA段所需胶浓度是 1.2-1.5%，分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%，DNA段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。

3、 DNA分子的构象

当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的，超螺旋DNA移动快，而线状双链DNA移动慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种 DNA。

4、电源电压

琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明，在低浓度、低电压下，分离效果较好。在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。但是，在电场强度增加时，不同分子量的DNA段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA段的分辨率达到较大，电场强度不宜高于5V/cm。

5、嵌入染料的存在

荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强，还会使线状DNA迁移率降低15%。

6、离子强度影响

电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率*小，几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液)，则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。对于天然的双链DNA，常用的几种电泳缓冲液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸]，TBE(Tris-硼酸和EDTA)，TPE(Tris-磷酸和EDTA)，一般配制成浓缩母液，储于室温。