几丁质主要存在于虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软体动物的器官(例如乌贼的软骨)，以及真菌类的细胞壁中，而几丁质酶(EC₃.2.1.14)可催化几丁质水解，具有抵御真菌侵染的作用，成为抗真菌病害的研究热点。

几丁质酶水解几丁质产生N-乙酰氨基葡萄糖，进一步与3.5-二硝基水杨酸产生棕红色化合物，在540nm处有特征吸收峰，吸光值增加速率反映了几丁质酶的活性。

产品组成：

提取液：液体80ml×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体40ml×1瓶，4℃保存，使用前摇匀。

试剂二：液体15ml×1瓶，4℃保存。

标准品：粉剂×1瓶。5mgN-乙酰氨基葡萄糖，4℃保存。临用前加入2.27ml蒸馏水配成10μmol/ml的标准溶液。

需自备的仪器和用品：

天平、水浴锅、离心机、可见分光光度计、1ml玻璃比色皿，研钵/匀浆器、蒸馏水。

操作步骤：

一、粗酶液提取

1.组织:按照组织质量(g) :提取液体积(ml)为1: 5～10的比例(建议称取约0.15g组织，加入1.5ml提取液)进行冰浴匀浆，然后10000rpm, 4℃离心20min,取上清，置冰上待测。

2.真菌:按照细胞数量(104个) :提取液体积(ml)为500～1000: 1的比例(建议500万细胞加入1ml提取液)，冰浴超声波破碎细胞(功率300w，超声3s，间隔7s，总时间3min) ；然后12000rpm, 4°C离心20min,取上清置于冰上待检。

3.培养液:直接测定。

二、测定操作表

1.可见分光光度计预热30min。波长调至540nm，蒸馏水调零。

2.将标准溶液稀释为4、3、2.5、2、1μmol/ml的标准溶液备用。

3.在EP管中分别加入:

三、计算公式

1、标准曲线的绘制:

以ΔA标准为 y轴，标准溶液浓度为 x轴。绘制标准曲线，得到标准方程 y=kx+b。将ΔA测定带入标准方程中，得到 x(μmol/ml)

2、几丁质酶活的计算: (1)按照样本重量计算

酶活性定义: 37℃下，每 g组织每小时分解几丁质产生 1μmolN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。

几丁质酶活性(U/g鲜重) =x×V样÷ (V样÷V样总×W)÷T=1.5×x÷W。

(2)按照蛋白质浓度计算

酶活性定义: 37℃下，每毫克蛋白每小时分解几丁质产生 1μmolN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。

几丁质酶活性(U/mg prot) =x×V样÷ (V样×Cpr)÷T=x÷Cpr。

(3)按照细胞数量计算

酶活性定义: 37℃下，每 10⁴个细胞每小时分解几丁质产生 1μmolN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。

几丁质酶活性(U/10⁴ cell) =x×V样÷ (V样÷V样总×细胞数量)÷T=1.5×x÷细胞数量。

(4)按照培养液体积计算

酶活性定义: 37℃下，每毫升培养液每小时分解几丁质产生 1μmolN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。

几丁质酶活性(U/ml) =x×V样÷ V样÷T=x。

V样:反应体系中样本体积，0.5ml；V样总:加入提取液体积，1.5ml；W:样本质量，g；Cpr:样本蛋白浓度，mg/ml；T:反应时间，1h.

注意事项:

1.反应结束后尽快进行比色。

2.吸光值大于 1.5时，样品适当稀释再测定，注意计算公式里乘以稀释倍数；或者缩短 37℃水浴时间到 X小时(如 0.5小时)，按照原先计算公式得到的结果再除以 X。