注意：正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

硝酸还原酶(NiR)是一类能催化亚硝酸盐还原的酶，广泛存在于微生物及植物体内，是自然界氮循环过程中的关键酶，可以将亚硝酸盐降解为 NO或 NH₃，从而减少环境中亚硝态氮的积累，降低因亚硝酸盐累积而造成的对生物体的毒害作用。

测定原理

亚硝酸还原酶可将 NO₂^-还原为 NO，使样品中参与重氮化反应生成紫红色化合物的 NO₂^-减少，即 540nm处吸光值的变化可反映亚硝酸还原酶的活性。

需自备的仪器和用品

天平、研钵、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、水浴锅、低温离心机。

试剂组成和配制

提取液：液体 112ml×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体 4ml×1瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加 5ml蒸馏水溶解。

试剂三：液体 5ml×1瓶，4℃保存。(如出现沉淀可以 70-80℃加热溶解)

试剂四：液体 10ml×1瓶，4℃避光保存。(如出现沉淀可以 70-80℃加热溶解)

试剂五：液体 10ml×1瓶，4℃避光保存。

工作液：临用前根据用量将试剂四和试剂五以 1:1的比例混合。

酶液提取

1.组织：按照组织质量(g)：提取液体积(ml)为 1：5～10的比例(建议称取约 0.1g组织，加入 1ml提取液)，进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2．细菌、真菌：按照细胞数量(104个)：提取液体积(ml)为 500～1000：1的比例(建议500万细胞加入 1ml提取液)，冰浴超声波破碎细胞(功率 300w，超声 3秒，间隔 7秒，总时间 3min)；然后 10000g，4℃离心 10min，取上清置于冰上待测。

测定操作表

计算公式

标准曲线：y = 1.3594x + 0.0072，R² = 0.9997；x为标准品浓度(μmol/ml)，y为吸光值(A标准管-A空白管)。

1．按照蛋白含量计算

酶活单位定义：每毫克组织蛋白每小时还原 1μmol NO₂ˉ的量为一个酶活力单位。

NiR(μmol/h/mg prot)= [A空白管-(A测定管-A对照管)-0.0072]÷1.3594×V标÷(V样×Cpr)÷T = 1.47×(A空白管-A测定管+A对照管-0.0072)÷Cpr

2.按照样本质量计算

酶活单位定义：每克组织每小时还原 1μmol NO₂^-的量为一个酶活力单位。

NiR(μmol/h/g鲜重)=[A空白管-(A测定管-A对照管)-0.0072]÷1.3594×V标÷(W ×V样÷V样总)÷T = 1.47×(A空白管-A测定管+A对照管-0.0072)÷W

3.按照细胞数量计算

酶活单位定义：每 10⁴个细胞每小时还原 1μmol NO ˉ的量为一个酶活力单位。

NiR(μmol/h/10⁴ cell)= [A空白管-(A测定管-A对照管)-0.0072]÷1.3594×V标÷(细胞数量

×V样÷V样总)÷T = 1.47×(A空白管-A测定管+A对照管-0.0072)÷细胞数量

V标：标准液体积，0.04ml；V样：体系中加入样本体积，0.02ml；V样总：加入提取液体积，1ml；T：反应时间，1h； Cpr：样本蛋白含量；W：样本质量，g

标准曲线：y = 0.6797x + 0.0072，R² = 0.9997；x为标准品浓度(μmol/ml)，y为吸光值(A标准管-A空白管)。

1．按照蛋白含量计算

酶活单位定义：每毫克组织蛋白每小时还原 1μmol NO₂ˉ的量为一个酶活力单位。

NiR(μmol/h/mg prot)= [A空白管-(A测定管-A对照管)-0.0072]÷0.6797×V标÷(V样×Cpr)÷T = 2.94×(A空白管-A测定管+A对照管-0.0072)÷Cpr

2.按照样本质量计算

酶活单位定义：每克组织每小时还原 1μmol NO₂^-的量为一个酶活力单位。

NiR(μmol/h/g鲜重)=[A空白管-(A测定管-A对照管)-0.0072]÷0.6797×V标÷(W×V样÷V样总)÷T = 2.94×(A空白管-A测定管+A对照管-0.0072)÷W

3.按照细胞数量计算

酶活单位定义：每 10⁴个细胞每小时还原 1μmol NO₂^-的量为一个酶活力单位。

NiR(μmol/h/10⁴ cell)= [A空白管-(A测定管-A对照管)-0.0072]÷0.6797×V标÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T = 2.94×(A空白管-A测定管+A对照管-0.0072)÷细胞数量

V标：标准液体积，0.04ml；V样：体系中加入样本体积，0.02ml；V样总：加入提取液体积，1ml；T：反应时间，1h； Cpr：样本蛋白含量；W：样本质量，g

注意事项

1.配制好的工作液 3天内使用完。

2.若吸光值超过 1.5，将上清液进行适当的稀释后再加入工作液显色，并在计算公式中乘以稀释倍数。

3.严格控制显色时间，否则会对结果有影响。

4.标准曲线线性范围为 0.03μmol/ml-1.5μmol/ml。

5.A空白管-(A测定管-A对照管)线性范围为 0.02-1.5。