注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

AAT是一个多功能蛋白大家族，主要负责催化生物体内各种酰基化和去酰基化反应，在基因表达、代谢和信号传导中具有重要作用。

测定原理：

AAT催化乙酰 CoA转移乙酰基到丁醇，释放的 CoA还原 DTNB生成 TNB；TNB在 412nm有吸收峰，测定 412 nm吸光度增加速率可计算 AAT活性。

自备仪器和用品：

研钵、冰、台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅、无水乙醇。

试剂组成和配制：

提取液：液体 100ml×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体 20ml×1瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存。

试剂三：粉剂×1支，4℃避光保存。

粗酶液提取：

1.组织：按照组织质量(g)：提取液体积(ml)为 1：5～10的比例(建议称取约 0.1g组织，加入 1ml提取液)进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心  10min，取上清置冰上待测。

2.细菌、真菌：按照细胞数量(104个)：提取液体积(ml)为 500～1000：1的比例(建议 500万细胞加入 1ml提取液)，冰浴超声波破碎细胞(功率 300w，超声  3秒，间隔 7秒，总时间 3min)；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

3.液体：直接检测。

1、分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长到 412 nm，蒸馏水调零。

2、工作液的配制：临用前在试剂二瓶中加入 18ml试剂一，充分混匀待用。用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

3、试剂三的配制：临用前加无水乙醇 1ml充分溶解待用，用不完的试剂 4℃保存。

4、空白管：在 Ep管或 96孔板中加入 10μL 提取液和 180μL工作液，充分混匀，35℃反应15min，加入 10μL试剂三，充分混匀，25℃静置 10min，测定 412nm处吸光值，记为 A空白管。

5、测定管：在 Ep管或 96孔板中加入 10μL 样本和 180μL工作液，充分混匀，35℃反应15min，加入 10μL试剂三，充分混匀，25℃静置 10min，测定 412nm处吸光值，记为 A测定管。△A=A测定管- A空白管，空白管只要做一管。

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按照蛋白浓度计算

活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol TNB定义为一个酶活单位。

AAT (nmol/min/mg prot) = △A÷(ε×d)×V反总÷(V样×Cpr)÷T = 98.04×△A÷Cpr

(2)按照样本质量计算

活性单位定义：每克组织每分钟催化产生 1nmol TNB定义为一个酶活单位。

AAT (nmol/min/g鲜重) = △A÷(ε×d)×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T= 98.04×△A÷W

(3)按细胞数量计算

活性单位定义：每 10⁴个细胞每分钟催化产生 1nmol TNB定义为一个酶活单位。

AAT (nmol/min/10⁴cell) = △A÷(ε×d)×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T= 98.04×△A÷细胞数量

(4)按液体体积计算

活性单位定义：每毫升样品每分钟催化产生 1nmol TNB定义为一个酶活单位。

AAT (nmol/min/ml) = △A÷( ε×d)×V反总÷V样÷T= 98.04×△A

ε：TNB消光系数，13600L/mol/cm；d：比色皿光径：1cm；V反总：反应总体积，0.2ml；

V样：加入反应体系中上清液体积，0.01ml；V样总：加入提取液体积，1ml；Cpr：蛋白含量，mg/ml；W：样本质量，g；T：反应时间，15 min。

b.使用 96孔板测定的计算公式如下

(1)按照蛋白浓度计算

活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol TNB定义为一个酶活单位。

AAT (nmol/min/mg prot) = △A÷(ε×d)×V反总÷(V样×Cpr)÷T=196.08×△A÷Cpr

(2)按照样本质量计算

活性单位定义：每克组织每分钟催化产生 1nmol TNB定义为一个酶活单位。

AAT (nmol/min/g鲜重) = △A÷(ε×d)×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T= 196.08×△A÷W

(3)按细胞数量计算

活性单位定义：每 10⁴个细胞每分钟催化产生 1nmol TNB定义为一个酶活单位。

AAT (nmol/min/10⁴cell) = △A÷(ε×d)×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T=196.08×△A÷细胞数量

(4)按液体体积计算

活性单位定义：每毫升样品每分钟催化产生 1nmol TNB定义为一个酶活单位。

AAT (nmol/min/ml) = △A÷(ε×d)×V反总÷V样÷T= 196.08×△A

ε：TNB消光系数，13600L/mol/cm；d：96孔板光径：0.5cm；V反总：反应总体积，0.2ml；

V样：加入反应体系中上清液体积，0.01ml；V样总：加入提取液体积，1ml；Cpr：蛋白含量，mg/ml；W：样本质量，g；T：反应时间，15min。