注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

GST 是一种具有多种生理功能的蛋白质家族，主要存在于细胞质内。GST 是体内解毒酶系统的重要组成部分，主要催化各种化学物质及其代谢产物与 GSH 的巯基共价结合，使亲电化合物变为亲水物质，易于从胆汁或尿液中排泄，达到将体内各种潜在或具备毒性的物质降解并排出体外的目的。因此，GST 在保护细胞免受亲电子化合物的损伤中发挥着重要的生物学功能。此外，因为 GST 具有 GSH-Px 活性，亦称为 non-Se GSH-Px，具有修复氧化破坏的大分子如 DNA、蛋白质等的功能。注意，GST 催化的反应减少 GSH 含量，但是不增加 GSSG 含量。

测定原理：

GST 催化 GSH 与 CDNB 结合，其结合产物的光吸收峰波长为 340nm；通过测定 340nm 波长处吸光度上升速率，即可计算出 GST 活性。 自备仪器和用品： 低温离心机、水浴锅、可调节移液器、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、 和蒸馏水。

试剂组成和配置：

试剂一：液体 120mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体 22mL×1 瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加 2 mL 蒸馏水溶解。

粗酶液提取：

1.组织：按照组织质量(g)：试剂一体积(mL)为 1：5～10 的比例(建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。

2.细菌、真菌：按照细胞数量(104  个)：试剂一体积(mL)为 500～1000：1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一)，冰浴超声波破碎细胞(功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min)；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

3.血清等液体：直接测定。

测定：

1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min，调节波长到 340 nm，用蒸馏水调零。

2. 试剂三放在 25℃(一般物种)或者 37℃(哺乳动物)保温。

3. 测定管：取微量石英比色皿或 96 孔板，加入 20μL 上清液，180μL 试剂二和 20μL 试剂三， 迅速混匀后于 340nm 测定吸光度变化，记录 10 s 和 310 s 吸光度为 A1 和 A2。 注意：空白管只需测定一次。

GST 活性计算公式：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算

活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分钟催化 1nmol/L CDNB 与 GSH 结合为1 个酶活单位。

GST(nmol/min/mg prot)=(A2-A1)÷ε÷d×109×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T

=230×(A2-A1)÷Cpr

(2). 按样本质量计算

活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每克样品每分钟催化 1nmol/L CDNB 与 GSH 结合为 1

个酶活单位。

GST(nmol/min/g 鲜重)=(A2-A1)÷ε÷d×109×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T

=230×(A2-A1)÷W

(3)按细胞数量计算

活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每 10⁴ 个细胞每分钟催化 1nmol/L CDNB 与 GSH 结合为 1 个酶活单位。

GST(nmol/min/10⁴ cell)=(A2-A1)÷ε÷d×109×V 反总÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T=230×(A2-A1)÷细胞数量

(4)按液体体积计算

活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每毫升液体每分钟催化 1nmol/L CDNB 与 GSH 结合为1 个酶活单位。

GST(nmol/min/mL)=(A2-A1)÷ε÷d×109×V 反总÷V 样÷T= 230×(A2-A1)

ε：产物摩尔消光系数，9.6×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；106：1mol=1×106μmol； V 反总：反应体系总体积，220μL=2.2×10^-4 L；Cpr：上清液蛋白质浓度(mg/mL)，需要另外测定，建议选用本公司生产的 BCA 蛋白质浓度测定试剂盒；W ：样品质量；V 样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02 mL；V 样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间(min)，5min。

b.使用 96 孔板测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算

活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分钟催化 1nmol/L CDNB 与 GSH 结合为1 个酶活单位。

GST(nmol/min/mg prot)=(A2-A1)÷ε÷d×109×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T=460×(A2-A1)÷Cpr

(2). 按样本质量计算

活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每克样品每分钟催化 1nmol/L CDNB 与 GSH 结合为 1个酶活单位。

GST(nmol/min/g 鲜重)=(A2-A1)÷ε÷d×109×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T=460×(A2-A1)÷W

(3)按细胞数量计算

活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每 10⁴ 个细胞每分钟催化 1nmol/L CDNB 与 GSH 结合为 1 个酶活单位。

GST(nmol/min/10⁴ cell)=(A2-A1)÷ε÷d×109×V 反总÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T=460×(A2-A1)÷细胞数量

(4)按液体体积计算

活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每毫升液体每分钟催化 1nmol/L CDNB 与 GSH 结合为1 个酶活单位。

GST(nmol/min/mL)=(A2-A1)÷ε÷d×109×V 反总÷V 样÷T=460×(A2-A1)

ε：产物摩尔消光系数，9.6×10³ L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；106：1mol=1×106μmol；V 反总：反应体系总体积，220μL=2.2×10^-4 L；Cpr：上清液蛋白质浓度(mg/mL)，需要另外测定，建议选用本公司生产的 BCA 蛋白质浓度测定试剂盒；W ：样品质量；V 样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02 mL；V 样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间(min)，5min。

注意事项：

1. 样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力；

2. 细胞中 GST 活性测定时，细胞数目须在 300 万-500 万之间，细胞中 GST 的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞；

3. 本法测定 GST 活性的线性范围可达 76 μmol/min/L，测定前先用 1～2 个样做预实验，如5min 内反应不成线性，须对样品用蒸馏水稀释，计算结果乘以稀释倍数；

4. 测定反映的温度对测定结果有影响，请控制在 25℃或者 37℃(哺乳动物)。