柠檬酸合成酶又称柠檬酸缩合酶,在三羧酸循环**步反应中,催化乙酰辅酶A的乙基与草酰乙酸的酮基结合生成柠檬酰辅酶A,以便后续高能硫酸键水解,释放出辅酶A,得到柠檬酸。柠檬酸合成酶是一个调控酶,此酶的底物乙酰辅酶A和草酰乙酸是它的激活剂,NADH、琥珀酰辅酶A是抑制剂。
试剂组成及配制:
(一)、前处理试剂:
提取液 20mL×1 瓶,4°C保存。
冲洗液 50mL×1 瓶,4°C保存。
(二)、反应试剂:
试剂一:4mL×1 瓶,4°C保存。
试剂二:0.6mL×1 支,-20°C避光保存。
试剂三:0.6mL×1 支,-20°C避光保存。
试剂四:0.2mL×1 支,4°C避光保存。
试剂盒存放:
本试剂盒收到后按规定条件存放,有效期6个月.
操作步骤:
1、样本前处理:样本处理详见说明书.
2、操作步骤:(96 孔板操作):(试剂盒附赠 96 孔板 1 块)
| 阴性对照孔 | 待测样本孔 |
试剂一(μl) | 190 | 190 |
试剂二(μl) | 25 | 25 |
试剂三(μl) | 25 | 25 |
轻摇混匀,37°C孵育箱温浴 3~5min;
| 阴性对照孔 | 待测样本孔 |
试剂四(μl) | 10 |
|
待测样本(μl) |
| 10 |
充分混匀(或 96 孔板以震荡混匀),并置于酶标仪中,波长 412nm,
测定初始吸光度 A0 值;转入 37°C孵育箱(或者在 37°C水浴箱)中温浴
15min,即刻放入酶标仪,测定吸光度 A15。
计算公式:
注:1、AU 代表测定孔吸光度值,AO 代表空白孔吸光度值。
2、微摩尔消光系数为 13.6×10-3;0.6cm 为光径换算结果;15 分钟为反应时间。
3、体系稀释倍数即为待测样本占反应液总量的比值。