完全培养基建议现用现配，一个月内用完（每次取用尽量减少暴露空气中的时间，取用后及时封口，避免 pH 快速升高）。

如培养体系小，建议根据实际用量将添加物分装冻存，按比例配制使用，避免反复冻融。

一般为 3 天（72h）左右。不同 hMSC 生长速度有差异，推荐以细胞汇合度选择准确传代时机，汇合度80-90%左右传代，汇合度过高（＞95%）会影响后续细胞生长。

梭形，呈旋涡状生长。

✔ 分离脐带华通氏胶组织，使用组织块贴壁法进行原代培养。每个T75培养瓶接种0.5g华通氏胶。37℃细胞培养箱培养1-2h后加入6-8ml培养基。D2-D3补充培养基5ml，D7-D10天换液，弃去上清，加入新培养基10-15ml，D12-D14天观察扩增情况，进行消化传代。

✔ 细胞最早爬出时间5-7天，镜下可以观察到少量零散细胞。

✔ 组织块贴壁效率高，贴壁的组织块多。

✔ 收获的细胞数更多。

• 相同的接种密度和培养时间条件下， novastem-MSC 体系P1-P5平均倍增次数为17.46倍。

• 以一根脐带为例，如分离约5g华通氏胶组织，P0代可获得2.0×10⁷细胞，P3代理论可获得9.8×10¹⁰的细胞。

• 按照常规使用剂量单份5×10⁷制备成产品，可制成1960份。

一般为3天（72h）左右。不同hMSC生长速度有差异，推荐以细胞汇合度选择准确传代时机，汇合度80-90%左右传代，汇合度过高（＞95%）会影响后续生长。培养基用量0.2mL/cm²。无需包被，连续培养3天无需换液。其他培养体系转换到novastem-MSC时，初始细胞扩增倍数可能较低。建议原培养基和novastem-MSC1:1混合后复苏接种，培养1代后可完全转换到novastem-MSC体系。

建议选用比较温和的胰酶，例如Gibco TrypLE™ Express 酶 （重组，1X），用PBS1:1稀释，配制成胰酶工作液后使用。消化时间约3分钟，一般不超过5分钟。消化1-2分钟后，可轻轻拍打培养容器，观察到大多数细胞脱落时即可用培养基终止消化。

建议DMSO终浓度5%。可以在消化前先配制DMSO：完全培养基=1:9（体积比）的冻存液，2-8℃预冷保存。待冻存细胞用完全培养基混匀后，缓缓加入等体积的冻存液，混匀后分装。

放行检验合格后，出具相应的COA，主要检测项目包括性状、理化、安全性及功能性指标。

培养的hMSCs表面标记物检测：

• CD73、CD90、CD105、HLA-ABC阳性率≥95.0%。

• CD14、CD19、CD34、CD45、HLA-DRDPDQ阳性率≤2.0%。

三系分化实验：

培养的hMSCs具有抑制淋巴细胞增殖、促进Treg上调、促进Th1和Th17下调和抑制TNF-α的表达。

Transwell研究

划痕试验

采用novastem-MSC干细胞无血清培养基培养的hMSCs，Transwell和划痕试验证明具有一定的迁移功能。

连续培养的hMSCs体外成瘤性试验结果：

hMSCs在软琼脂克隆法中均无法形成克隆，提示其在体外不具备成瘤性。