产品及特点

节菱孢霉菌(Arthrinium spp.)简称节菱孢或节菱孢菌，是一类产毒霉菌，有 20多个种，其中使甘蔗变质并产生有神经毒素的节菱孢霉菌主要是甘蔗节菱孢菌(Arthrinium sachari)、暗孢节菱孢菌(Arthrinium phaeospermum)和蔗生节菱孢菌(Arthrinium saccharicola)。其产生的毒素为 3-硝基丙酸，是一种耐热性水溶性有毒物质，主要损害中枢神经系统。从某种意义上讲，有甘蔗存在，就有节菱孢菌威胁人体健康的潜在危险存在，因此快速检测节菱孢霉属具有重要意义。本产品就是以探针法荧光定量 PCR技术为基础开发的专门检测节菱孢霉属通用的试剂盒，它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提供样品 DNA模板。

2、引物和探针经过优化，灵敏性高。

3、提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4、特异性高，引物是根据节菱孢霉属通用高度保守区设计。

5、本产品足够 50次 20μL体系的探针法荧光定量 PCR反应。

6、本产品只能用于科研。

规格及成分

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为 12个月。

自备试剂

样品 DNA。

使用方法

一、稀释PCR阳性对照(以 10E1-10⁶拷贝/μL这 6个 10倍稀释度为例)

如果做定性实验，则此步可以跳过。如果做定量实验，则需要稀释阳性对照做标准曲线。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。本产品只提供 DNA片段作为阳性对照。

1、标记 6个离心管，分别为 6，5，4，3，2，1。

2、用带芯枪头分别加入 45μL荧光 PCR专用模板稀释液(**用带芯枪头，下同)。

3、在 6号管中加入 5μL1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4、换枪头，在 5号管中加入 5μL1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得 1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5、换枪头，在 4号管中加入 5μL1×10⁵拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁴拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6、重复上面的操作直到得到 6个稀释度的标准曲线样品。放冰上用。

二、样品 DNA的制备

7、如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是样品制备PC(样品制备阳性对照)，一个是样品制备 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL阳性对照的 10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为样品制备 PC。另外用水作为样品制备 NC。

8、用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA提取试剂盒兼容。

三、ProbeqPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

9、如果做定量分析并且只做 1次重复，则标记 N+9个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1次重复，则标记 N+4个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于 PCR阳性对照(用第 4号管中的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为描述操作步骤。

10、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：

11、盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR：

四、数据处理

12、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log值为横轴，以 Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品 DNA浓度的 log值，再推算出其浓度。

13、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于 35。对待测样品，如果其 Ct大于或等于 40则为阴性，如果小于或等于 35则为阳性。如果在 35-40之间，则重复一次。重复实验的 Ct值如果大于或等于 40则为阴性，如果小于 40，则为阳性。