产品及特点

灭鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)是气单胞菌属(Aeromonas)细菌的一个种 ，是引起鲑鳟鱼类疖疮病及溃疡病的最主要病原菌，给鲑科 (Salmonidae)鱼类养殖带来严重损失。近年来研究表明，该菌宿主范围逐渐扩大，可感染除了鲑科外的其他水产动物，如刺参、斑点叉尾鲙、乌鳢和大菱鲆等。对灭鲑气单胞菌的检测主要依赖于传统的微生物分离培养鉴定方法，其操作过程费时、繁琐，且很难得到准确结果，常常延误病情的诊断，而且对于已感染该菌但尚未发病的鱼类，通过常规分离鉴定方法很难得到准确结果。本产品就是以探针法荧光定量 PCR技术为基础开发的专门检测灭鲑气单胞菌的试剂盒，它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提供样品 DNA模板。

2、引物和探针经过优化，灵敏性高。

3、提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4、特异性高，引物是根据灭鲑气单胞菌高度保守区设计，不会跟其他病原 DNA发生交叉反应。

5.本产品足够 50次 20μL体系的探针法荧光定量 PCR反应。

6.本产品只能用于科研。

规格及成分

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为 12个月。

自备试剂

样品 DNA。

使用方法

一、稀释标准曲线样品(以 10²-10⁷拷贝/μL这 6个 10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA片段作为阳性对照。

1、标记 6个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

2、用带芯枪头分别加入 45  μL荧光 PCR专用模板稀释液，**用带芯枪头，下同)。

3、在 7号管中加入 5 μL 1×10⁸拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁷拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4、换枪头，在 6号管中加入 5  μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5、换枪头，在 5号管中加入 5  μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6、重复上面的操作直到得到 6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。二、样品 DNA的制备

7、如果有 N个样品，**设置 N+2个提取，多出的一个是 PC(样品制备阳性对照)，一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL阳性对照的 10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。

8、用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA提取试剂盒兼容。

三、Probe qPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

9、如果做定量分析并且只做 1次重复，则标记 N+9个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1次重复，则标记 N+4个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于 PCR阳性对照(用第 4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：

11、盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR：

四、数据处理

12、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log值为横轴，以 Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品 RNA浓度的 log值，再推算出其浓度。

13、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct大于或等于 40则为阴性，如果小于或等于 35则为阳性。如果在 35-40之间，则重复一次。若重复结果 Ct值小于 40，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。