PFK(EC 2.7.1.11)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，负责将果糖-6-磷酸和ATP转化为果糖-1,6二磷酸和ADP，是糖酵解过程的关键调节酶之一。

PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-1,6-二磷酸和ADP，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD+，在340nm下测定NADH下降速率，即可反映PFK活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品内容：

溶液的配制：

1.试剂二：临用前加入17ml试剂一和1.13ml蒸馏水充分溶解，置于37℃(哺乳动物)或25℃(其他物种)水浴5分钟，用不完的试剂-20℃分装保存一周；

2.试剂三：液体置于试剂瓶内EP管中。临用前根据用量按照试剂三:蒸馏水为1:50的体积比例充分混匀，现用现配；用不完的试剂三原液建议-20℃分装保存，避免反复冻融；

3.试剂四：液体置于试剂瓶内EP管中。临用前根据用量按照试剂四:蒸馏水为 1:125的体积比例充分混匀，现用现配。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板(UV)、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本的前处理

1.细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量(104个)提取液体积(ml)为500-1000：1的比例(建议500万细菌或细胞加入1ml提取液)，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率20%或者200W，超声3s，间隔10s，重复30次)；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2.组织：

按照组织质量(g)：提取液体积(ml)为1:5-10的比例(建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液)，进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

3.血清(浆)样品：直接检测。

二、测定步骤

1.分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2.样本测定在微量石英比色皿或96孔UV板中加入10μL样本、10μL试剂三、10μL试剂四和170μL试剂二，混匀，立即记

录340nm处20s时的吸光值A1，比色后迅速将比色皿或96孔板连同反应液一起放入37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴或恒温箱中，准确反应10分钟；迅速取出比色皿并擦干，340nm下比色，记录10分20秒时的吸光度 A2，计算ΔA=A1-A2。

三、PFK 活力单位的计算：

1.血清(浆)PFK活力的计算:

单位的定义：每毫升血清(浆)在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFK(U/ml)=[△A×V反总÷(ε×d)×10⁹ ]÷V样÷T=321×△A

2.组织、细菌或细胞中PFK活力的计算:

(1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFK(U/mg prot)＝[△A×V反总÷(ε×d)×10⁹ ]÷(Cpr×V样)÷T=321×△A÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFK(U/g鲜重)＝[△A×V反总÷(ε×d)×10⁹ ]÷(W×V样÷V样总)÷T=321×△A÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFK(U/10⁴ cell)＝[△A×V反总÷(ε×d)×10⁹ ]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.642×△A

V反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1 cm；V样：加入样本体积，0.01ml；V样总：加入提取液体积，1ml；T：反应时间，10min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

1.血清(浆)PFK活力的计算:

单位的定义：每毫升血清(浆)在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFK(U/ml)=[△A×V反总÷(ε×d)×10⁹ ]÷V样÷T=535×△A

2.组织、细菌或细胞中PFK活力的计算：

(1)按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFK(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹ ]÷(Cpr×V样)÷T=535×ΔA÷Cpr

(2)按样本质量计算

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFK(U/g质量)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹ ]÷(W×V样÷V样总)÷T=535×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞数量计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。

PFK(U/10⁴ cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹ ]÷(500×V样÷V样总)÷T=1.07×ΔA

反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：96孔板光径，0.6cm；V样：加入样本体积，0.01ml；V样总：加入提取液体积，1ml；T：反应时间，10min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml； W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万；109，单位换算系数，1mol=10⁹nmol。

注意事项：

1.测定过程中试剂三、试剂四和样本在冰上放置，以免变性和失活。

2.比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

3.**两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

4.不同匀浆组织中PFK活力不一样，做正式试验之前请坐1-2个预实验，若ΔA>0.5，则说明活力太高，必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液(计算式中乘以相应稀释倍数)，或缩短反应时间至2min或5min，使 ΔA<0.5，以提高检测的灵敏度。