正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

AGP (EC 2.7.7.21)主要存在于植物中，催化葡萄糖-1-磷酸与 ATP 反应生成淀粉合成的直接前体 ADPG，是植物淀粉生物合成的主要限速步骤。

测定原理

AGP 催化的逆向反应生成 G1P，在反应体系中添加的磷酸己糖变位酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化生成 6-磷酸葡萄糖酸和 NADPH，340nm 下测定 NADPH 增加速率，即可计算AGP 活性。

需自备的的仪器和用品

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、 研钵、冰和蒸馏水

试剂的组成和配制

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 20mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 9mL 蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装 后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 4mL 蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装 后-20℃保存，禁止反复冻融；

粗酶液制备

按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1：5～10 的比例(建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液)，进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、试剂一置 30℃保温 10min 以上。

3、在 EP 管中按顺序加入下列试剂

混匀，30℃保温 15 min，置沸水浴中 1 min(盖紧，防止水分散失)，冰浴迅速冷却后，4000g 4℃ 离心 5min，取上清液，在 96 孔板中依次加入下列试剂

混匀后，立即于 340 nm 波长下记录初始吸光度 A1 和 2min 后的吸光度 A2，计算ΔA=A2-A1。

AGP 活性计算

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

1、按样本蛋白蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活性单位。

AGP(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T×稀释倍数=2813×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2、按照样本鲜重计算

单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

AGP(nmol/min /g 鲜重)＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W× V 样÷V 样总)÷T×稀释倍数=2813×ΔA÷W

V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d： 比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T： 反应时间，2 min；稀释倍数：1.75；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量。

b.使用 96 孔板测定的计算公式如下：

1、按样本蛋白蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活性单位。

AGP(nmol/min /mg prot)＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T×稀释倍数=5627×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2、按照样本鲜重计算

单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

AGP(nmol/min /g 鲜重)＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T×稀释倍数=5627×ΔA÷W

V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：

96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T： 反应时间，2 min；稀释倍数：1.75；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量。