实验报告：

一、CNE(鼻咽癌细胞)分离与培养：

    1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，最后将组织剪成1mm3左右大小；

    2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

    3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织完全被消化；

    4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；

    5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；

二、免疫荧光鉴定：

    1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

    2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

    3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；

    4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗（Abbioscience公司），然后将其放在4℃箱中孵育细胞过夜；

    5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

    6、用PBS冲洗3次，每次10min，最后在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

特性：

安全性：所有肿瘤和病转染的细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需高压灭菌后方能丢弃。收到细胞后，在倒置镜下好是在4X物镜)观察整个细胞生长情况

（一）如果细胞未长满，用75%酒精喷洒整个瓶消后放到超菌台内，严格无菌操作，打开细胞培养瓶，吸出培养液，换 10ml新鲜培养液后继续培养。

(二)如果细胞已长满，即可进行传代培养。具体步骤如下：

1. 弃去培养液，用PBS（不含钙,镁离子）洗1-2次。

2. 加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，倒放于37℃培养箱1-3分钟预热，之后翻转培养瓶10-30秒后，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量完全培养基终止消化。

3. 按6-8ml/瓶补加完全培养基，轻轻打匀后吸出一半，分到新的培养瓶中。

细胞特性：

1)组织来源于实验动物的正常眼组织。

2)细胞鉴定：细胞角蛋白-18(CK-18)免疫荧光染色为阳性。

3)经鉴定细胞纯度高于90%。

4)不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。

5)细胞生长方式：上皮样，不规则细胞，贴壁培养。

注意事项：

1、观察细胞zui好在低倍镜（4或5X物镜)下进行，否则不能准确判断细胞的传代密度。看细胞的形态请在10X或20X物镜下。

2、瓶中运输培养基不能重复再用,请换用加双抗的新培养基，细胞冻存后,培养基中可不加任何抗生素。

3、有些细胞贴壁不牢，如发现贴壁细胞有脱落，可离心吹打后接种到新瓶内。

4、收到细胞后，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请及时与我们。

ZNF763 ELISA KitRat Tshb(Thyrotropin subunit beta) ELISA KitN-对甲苯磺酰甘氨酸细胞磷酸腺苷脱氨酶（AMPD）活性比色法定量检测试剂盒

ZNF750 ELISA KitRat BMP-4(Bone morphogenetic protein 4) ELISA Kit三七皂苷R1组织磷酸腺苷脱氨酶（AMPD）活性比色法定量检测试剂盒

MTRR (Methionine synthase reductase) ELISA KITRat IGFBP-1(Insulin-like growth factor-binding protein 1) ELISA Kit1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺细胞β氨基己糖苷酶（β-hexosaminidase）活性比色法定量检测试剂盒

ACTL9 (Actin-like protein 9) ELISA KITRat IGFBP-2(Insulin-like growth factor-binding protein 2) ELISA Kit1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺组织β氨基己糖苷酶（β-hexosaminidase）活性比色法定量检测试剂盒

PGLS (6-phosphogluconolactonase) ELISA KITRat IGFBP-3(Insulin-like growth factor-binding protein 3) ELISA Kit5-降片烯-2,3-二羧酸酐细胞纤维素酶（cellulase）活性比色法定量检测试剂盒

PFKFB1 (6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase 1) ELISA KITRat VEGF-B(Vascular Endothelial Cell Growth Factor B) ELISA Kit5-降片烯-2,3-二羧酸酐组织纤维素酶（cellulase）活性比色法定量检测试剂盒

DHCR7 (7-dehydrocholesterol reductase) ELISA KITRat Flt1/VEGFR1(Vascular endothelial growth factor receptor 1) ELISA KitN,N-二甲基十二烷胺-N-氧化物(DDAO)细菌纤维素酶（cellulase）活性比色法定量检测试剂盒

AAK1(AP2-associated protein kinase 1) ELISA KitRat Cga(Glycoprotein hormones alpha chain) ELISA Kit5-硝基噻吩-2-羧酸真菌/酵母纤维素酶（cellulase）活性比色法定量检测试剂盒

ORAI1 ELISA KitPol II/RNA polymerase II  RNA聚合酶II抗体1,3,5-三溴苯麦冬皂苷B进口/国产H5N1-H5  禽流感H5亚型全病抗体含量：HPLC≥98%

INSR(Insulin receptor) ELISA KitMkl1/MRTF-A  myocardin相关转录因子抗体1,3,5-三溴苯麦冬皂苷C进口/国产Newcastle disease virus  鸡新城疫疫苗（鸡瘟4型混合病）抗体含量：HPLC≥98%

OSGEPL1 ELISA KitDlx5  同源转录因子DLX5抗体正硅酸丁酯麦冬皂苷D'进口/国产CD3 epsilon  CD3抗体含量：HPLC≥98%

ORAI2 ELISA KitFXR2  脆性X相关蛋白2抗体正硅酸丁酯麦冬皂苷D'进口/国产CD3 epsilon  CD3抗体含量：HPLC≥98%

OSGIN1 ELISA KitPLC β1/Phospholipase C beta 1  磷酯酶Cβ1抗体正硅酸丁酯麦冬二氢高异黄A进口/国产CD4  CD4抗体含量：HPLC≥98%

ORAI3 ELISA KitEHZF/ZN521  锌指蛋白521抗体2-三氟甲基-4-羟基吡啶麦冬二氢高异黄A进口/国产CD45/B220  白细胞共同抗原抗体含量：HPLC≥98%

ORC5L ELISA KithnRNP R  异质性核糖核蛋白R2-三氟甲基-4-羟基吡啶山茱萸新苷进口/国产CD45/B220  白细胞共同抗原抗体含量：HPLC≥98%

ORC4L ELISA KitAKAP5  A激酶锚定蛋白5抗体2-三氟甲基-4-羟基吡啶山茱萸苷进口/国产CD45/B220  白细胞共同抗原抗体含量：HPLC≥98%

特性：

安全性：所有肿瘤和病转染的细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需高压灭菌后方能丢弃。收到细胞后，在倒置镜下好是在4X物镜)观察整个细胞生长情况

（一）如果细胞未长满，用75%酒精喷洒整个瓶消后放到超菌台内，严格无菌操作，打开细胞培养瓶，吸出培养液，换 10ml新鲜培养液后继续培养。

(二)如果细胞已长满，即可进行传代培养。具体步骤如下：

1. 弃去培养液，用PBS（不含钙,镁离子）洗1-2次。

2. 加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，倒放于37℃培养箱1-3分钟预热，之后翻转培养瓶10-30秒后，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量完全培养基终止消化。

3. 按6-8ml/瓶补加完全培养基，轻轻打匀后吸出一半，分到新的培养瓶中。