实验报告：

一、HEL299(红白细胞白血病细胞)分离与培养：

    1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，最后将组织剪成1mm3左右大小；

    2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

    3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织完全被消化；

    4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；

    5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；

二、免疫荧光鉴定：

    1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

    2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

    3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；

    4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗（Abbioscience公司），然后将其放在4℃箱中孵育细胞过夜；

    5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

    6、用PBS冲洗3次，每次10min，最后在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

特性：

安全性：所有肿瘤和病转染的细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需高压灭菌后方能丢弃。收到细胞后，在倒置镜下好是在4X物镜)观察整个细胞生长情况

（一）如果细胞未长满，用75%酒精喷洒整个瓶消后放到超菌台内，严格无菌操作，打开细胞培养瓶，吸出培养液，换 10ml新鲜培养液后继续培养。

(二)如果细胞已长满，即可进行传代培养。具体步骤如下：

1. 弃去培养液，用PBS（不含钙,镁离子）洗1-2次。

2. 加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，倒放于37℃培养箱1-3分钟预热，之后翻转培养瓶10-30秒后，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量完全培养基终止消化。

3. 按6-8ml/瓶补加完全培养基，轻轻打匀后吸出一半，分到新的培养瓶中。

细胞特性：

1)组织来源于实验动物的正常眼组织。

2)细胞鉴定：细胞角蛋白-18(CK-18)免疫荧光染色为阳性。

3)经鉴定细胞纯度高于90%。

4)不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。

5)细胞生长方式：上皮样，不规则细胞，贴壁培养。

注意事项：

1、观察细胞zui好在低倍镜（4或5X物镜)下进行，否则不能准确判断细胞的传代密度。看细胞的形态请在10X或20X物镜下。

2、瓶中运输培养基不能重复再用,请换用加双抗的新培养基，细胞冻存后,培养基中可不加任何抗生素。

3、有些细胞贴壁不牢，如发现贴壁细胞有脱落，可离心吹打后接种到新瓶内。

4、收到细胞后，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请及时与我们。

EVX2 (Homeobox even-skipped homolog protein 2) ELISA KITMouse Bnip3(BCL2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3) ELISA KitN,N-二甲胺基磺酰氯组织过氧化氢酶（CATALASE）过氧化活性比色法定量检测试剂盒

FCHSD2 (F-BAR and double SH3 domains protein 2) ELISA KITMouse Cd74(HLA class II histocompatibility antigen gamma chain) ELISA KitN,N-二甲胺基磺酰氯细菌过氧化氢酶（CATALASE）过氧化活性比色法定量检测试剂盒

SLC30A3(Zinc transporter 3) ELISA KitMouse Cby1/PGEA1(Protein chibby homolog 1) ELISA KitN{α}-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐植物过氧化氢酶（CATALASE）过氧化活性比色法定量检测试剂盒

EWSR1 (RNA-binding protein EWS) ELISA KITMouse Chit1(Chitotriosidase-1) ELISA KitN{α}-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐细胞谷胱甘肽（GLUTATHIONE）总浓度比色法定量检测试剂盒

EXO5 (Exonuclease V) ELISA KITMouse Ccs(Copper chaperone for superoxide dismutase) ELISA Kit正辛酸血液谷胱甘肽（GLUTATHIONE）总浓度比色法定量检测试剂盒

FCHO1 (F-BAR domain only protein 1) ELISA KITMouse Dapk1(Death-associated protein kinase 1) ELISA Kit3-氨基-2-硝基吡啶组织谷胱甘肽（GLUTATHIONE）总浓度比色法定量检测试剂盒

FCHO2 (F-BAR domain only protein 2) ELISA KITMouse Dera(Deoxyribose-phosphate aldolase) ELISA Kit3-氨基-2-硝基吡啶体液谷胱甘肽（GLUTATHIONE）总浓度比色法定量检测试剂盒

EXTL1 (Exostosin-like 1) ELISA KITMouse DHFR(Dihydrofolate reductase) ELISA Kit1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐植物谷胱甘肽（GLUTATHIONE）总浓度比色法定量检测试剂盒

POLR2J2 ELISA KitS100PBP/S100P binding protein  S100P结合蛋白抗体3,8-二氮杂螺[4.4]壬烷-8-羧酸叔丁酯1%NaCl蔗糖

POU2AF1 ELISA KitSAMD14  SAMD14抗体3,8-二氮杂螺[4.4]壬烷-8-羧酸叔丁酯鸟氨酸脱羧酶肉汤

COX4I1(Cytochrome c oxidase subunit 4 isoform 1, mitochondrial) ELISA KitCDMP1/GDF5  软骨衍生形态发生蛋白1抗体3,8-二氮杂螺[4.4]壬烷-8-羧酸叔丁酯MR-VP

POU3F3 ELISA KitRNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S2)  磷酸化RNA聚合酶II CTD抗体1,2,3,4-四氢喹啉木糖-明胶培养基

POLR3A ELISA KitRNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S5)  磷酸化RNA聚合酶II CTD抗体1,2,3,4-四氢喹啉动力-硝酸盐培养基

COX5A(Cytochrome c oxidase subunit 5A, mitochondrial) ELISA KitRNASE4/Angiogenin  血管生成素核糖核酸酶4抗体(肌萎缩性侧索硬化症蛋白)乙酸叔丁酯酚红葡萄糖肉汤

POLR2J2 ELISA KitDUT  脱氧尿苷三磷酸酶DUT抗体乙酸叔丁酯硝酸盐肉汤（还原）

POLR2L ELISA KitDesmoglein 3/DSG3  桥粒芯蛋白3抗体N-Boc-溴乙胺氰化钾实验生化管

特性：

安全性：所有肿瘤和病转染的细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需高压灭菌后方能丢弃。收到细胞后，在倒置镜下好是在4X物镜)观察整个细胞生长情况

（一）如果细胞未长满，用75%酒精喷洒整个瓶消后放到超菌台内，严格无菌操作，打开细胞培养瓶，吸出培养液，换 10ml新鲜培养液后继续培养。

(二)如果细胞已长满，即可进行传代培养。具体步骤如下：

1. 弃去培养液，用PBS（不含钙,镁离子）洗1-2次。

2. 加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，倒放于37℃培养箱1-3分钟预热，之后翻转培养瓶10-30秒后，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量完全培养基终止消化。

3. 按6-8ml/瓶补加完全培养基，轻轻打匀后吸出一半，分到新的培养瓶中。