木质素是木质纤维素生物质的主要成分，是地球上最大的可再生芳烃来源，可用于生物精炼和造纸工业，全球木质素的年产量已上升到约5000万吨。然而，以焚烧或堆放填埋处理木质素废物的传统方法存在资源利用效率低下和严重的环境污染问题。随着人们认识到木质素作为生物燃料、化学品和工业品材料的巨大潜在价值，其废物利用逐渐成为可持续生物经济领域的热门课题。

聚羟基链烷酸酯(PHA)作为一种来源于微生物合成的可生物降解聚酯，以其卓越的生物相容性和热力学性能，在多个领域展现出巨大潜力，包括制造可生物降解材料、作为化妆品中的生物基美容面膜成分，以及医疗领域中的手术缝合线。然而，由于原材料价格高昂，PHA的商业化应用一直受到限制。

近年来，科学家们致力于开发将木质素转化为PHA的微生物转化技术，并显示出了广阔的应用前景。特别是利用恶臭假单胞菌的特殊代谢途径，木质素衍生的芳香化合物，如对香豆酸(p-CA)和阿魏酸(FA)，能够被有效转化为PHA的关键构建单元。然而，这一转化过程并非易事，其效率受到多种因素的制约，包括分馏技术、菌株种类的选择以及底物的性质等。

为了克服这些挑战，研究人员采用了一系列创新方法，如合成生物学技术、基因工程改造和优化发酵策略等。这些方法不仅提高了木质素到PHA的转化效率，还改善了PHA组成的均一性，为PHA的商业化应用铺平了道路。

天津大学的研究团队近日取得了突破性进展，他们通过一系列巧妙的工程策略显著优化了聚羟基链烷酸酯(PHA)的积累并调整了其单体组成。这些策略包括精准地阻断PHA的降解路径、增强PHA的生物合成能力，并对β氧化途径进行了重新设计。基于这些创新方法，他们成功构建了一株名为KT2440的工程化恶臭假单胞菌。

当结合补料分批发酵技术时，这株工程化菌株所生成的PHA含量大幅提升，最高值达到2.46g/L，与传统的分批模式相比，这一数值增长了惊人的143.6%。同时，其PHA单体比例的调整也取得了显著成果，最高单体比例达到了91.4%，显示了极高的纯度。

更为值得一提的是，当使用真实的木质素水解产物作为原料时，这株工程化菌株不仅表现出了顽强的生长能力，而且能够以高达85%的均匀性生产出0.93g/L的PHA。

这篇文章已经以“Valorizing Lignin and Coprecursors into Homogeneous Polyhydroxyalkanoates by Engineered Pseudomonas putida”为题发表在 ACS Sustainable Chemistry & Engineering 上。该研究团队的负责人是天津大学元英进院士，他主要从事人工基因组设计合成、基因组重排、DNA信息存储、天然产物人工生物合成、以及生物过程强化等领域的研究。

在这项深入研究中，天津大学的研究团队首先探讨了木质素衍生的芳香族化合物以及不同碳源(葡萄糖、醋酸、甘油和脂肪酸)混合喂养对假单胞菌KT2440产生PHA的效能。他们发现，这些碳源的组合不仅影响PHA的总体产量，还能调控其单体成分的比例。特别地，脂肪酸在提升PHA产量方面展现出了显著效果，并且随着碳链长度的增长，其促进作用也相应增强。

此外，不同的碳源组合对PHA单体组成及其比例产生了差异化的影响。举例来说，当同时喂养脂肪酸(FA)与辛酸时，24小时内PHA的产量(以g/g干重细胞为单位)和滴度(以g/L为单位)分别达到了0.56 g/g和0.92 g/L，相比仅喂养FA的情况，其增长幅度高达75%和130%。当选择庚酸或辛酸作为碳源时，PHA的主要单体分别为3-羟基庚酸酯(3HHp)和3-羟基辛酸酯(3HO)。

进一步的研究发现，随着发酵时间的延长，恶臭假单胞菌KT2440中的PHA含量呈现下降趋势。通过深入分析，研究团队发现PhaZ基因(编码PHA解聚酶)在PHA降解过程中扮演了关键角色。为了验证这一发现，他们删除了KT2440的PhaZ基因，得到了新的菌株KTYY01。在仅使用p-CA作为碳源的情况下，KTYY01的PHA含量和浓度分别增加了37.5%和35.7%。在与辛酸共同喂养时，KTYY01的PHA产量相比KT2440有了63.6-84.2%的提升。与FA共同喂养时也观察到了类似的提升效果，特别是当与辛酸共同喂养时，PHA的含量和浓度分别比KT2440增加了23.2%和43.5%。此外，PhaZ基因的缺失并未改变PHA的单体组成，并且还有助于在碳源有限条件下的长期培养。

此外，研究团队采取了遗传工程手段以提高 PHA 的合成效率和调节其单体组成。PhaG、PhaJ4和PhaC这三个基因分别在(R)-3-羟酰基-ACP转化为(S)-3-羟酰基脂肪酸、反式 Δ2-烯酰辅酶A转化为底物(R)-羟酰辅酶 A 以及将(R)-羟酰辅酶A聚合成PHA聚合物的过程中起关键作用，通过过表达这三个基因，他们成功引导了更多的碳通量进入PHA的生物合成。在此基础上，通过敲除无关基因 aldB来过表达PhaC基因构建了假单胞菌KTYY04菌株，该菌株在p-CA和辛酸共同喂养下，除了PHA含量和浓度显著增加外，还将PHA中3HO的含量从50%提高到 76%，实现了对PHA单体组分的实质性控制，而FA与辛酸的共同喂养条件下，3HO的成分比例更是高达80%。

在后续研究中，科研人员认识到PHA的合成与脂肪酸β氧化途径中的中间体紧密相关。基于这一发现，他们通过敲除FadBA基因成功构建了KTYY06菌株。这一改造中断了脂肪酸的β氧化过程，并导致了3-羟酰辅酶A前体的积累。他们利用这一特点，结合奇链脂肪酸和偶数链脂肪酸作为前体，来调节PHA的单体组成。研究结果显示，虽然KTYY06菌株在消耗短链脂肪酸的能力上有所降低，但通过与庚酸或辛酸等中链脂肪酸共同喂养p-CA或FA，该菌株展现了出色的细胞生长能力，并显著促进了PHA的积累与单体组成的优化。

鉴于芳香族底物浓度增加时可能对PHA生产产生限制，研究团队进一步设计了不同的发酵策略，旨在优化在芳烃和有限脂肪酸共同喂养下的细胞生长和PHA积累。

他们采用了五种补料分批发酵模式(标记为F-BM1至F-BM5)。其中，F-BM1模式以低浓度的p-CA和辛酸作为起始碳源，在低氮条件下启动发酵过程。相比之下，F-BM2模式通过提高p-CA的浓度，显著提高了PHA的积累效果，使得干燥细胞的PHA积累量达到0.84 g/g，PHA浓度更是高达2.46 g/L，与之前的策略相比，PHA的积累量和浓度分别增长了47.4%和143.6%，同时维持了高达91.4%的最大单体比例。而F-BM3、F-BM4和F-BM5模式则在第一轮发酵中使用高氮浓度，第二轮则转为低氮条件。

虽然这些模式在一定程度上提高了PHA的均匀性，但在促进PHA积累方面并未超越F-BM1和F-BM2模式。经过分析，研究团队认为高氮浓度可能并不利于PHA的积累，同时，芳香族底物浓度的提升对细胞生长产生了负面影响。

研究团队最后深入探究了恶臭假单胞菌KTYY06菌株在真实木质素流和碱性预处理液(APL)环境中生产PHA的潜力和效果。实验数据表明，KTYY06菌株具备在含木质素水解物的复杂培养基中生存和生长的能力。然而，在仅依赖木质素衍生物为碳源时，PHA的积累效率并不理想。

为了提升PHA的生产效果，研究团队尝试采用辛酸前体作为共同喂养物，此举显著促进了细胞生长并增加了PHA的积累量。共同喂养辛酸后，干燥细胞的PHA含量显著提升至0.32 g/g，浓度也高达0.93 g/L。此外，PHA的单体构成以3HD为主，占比高达85%，这一变化使得PHA的物理性质转变为低结晶度的软聚酯，从而展现出更为柔软的特质。

综上所述，通过基因编辑、前体选择和发酵条件优化等多维度的策略，本研究为高效生产高均质性的PHA开辟了新的途径。这种创新的生产策略具有重要的实际应用价值，为未来高级应用领域提供了具有特定性能的定制化PHA材料。